骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem eell，MMSC)为骨髓基质细胞(marrow—derived stromal cell，MDSC)的前体细胞，两者在体外培养条件下的形态不同。骨质干细胞可生成血细胞，而且能自我更新和分化成为各种子细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞。

(一)骨髓MSC的分离培养

1．材料

(1)骨髓细胞。

(2)试剂与培养液：Percoll分层液(密度为1．037g／ml)、抗凝剂(肝素)、MSC培养液[DMEM(低糖)+15％FBS]，O．25％胰蛋白酶0．02％EDTA，PBS(pH8．6)。

(3)器具：培养瓶、培养皿、离心管、离心机、毛细管等。

2．方法

(1)用25ml抗凝的骨髓与等量PBS混合，置离心管内于室温下1500r／min离心10 min，再用PBS洗2次，重新悬浮细胞。

(2)将洗涤后的浓度为4×107ml的细胞悬液2～5m1轻轻铺于2～5ml Percoll分层液上，20℃下1500r／min离心30min，用毛细滴管仔细收集中间相的有核细胞。

(3)将收集细胞用含5％FBS的PBS洗涤2次，重新悬浮细胞于人MSC培养液中，移人185cm2的培养瓶中，细胞数目为3×107个，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。

(4)48h后换液，以后每3d换1次MSC培养液。当90％的细胞融合时，用O．25％胰蛋白酶一0．02％EDTA消化3．5min，将消化下来的细胞洗涤，并以1×106／185cm2的细胞浓度分装于培养瓶中进行传代培养。

(5)MSC经传代后建立细胞系。为避免核型出现异常，建系后及早期培养传代中需不断地加以冻存，同时用CD试剂盒检测MSC的标志。人MSC表面蛋白CD105、CDl66、CD29、CD44为阳性。

(6)培养人的MSC系，换高糖型[)MEM加10％FBS，L谷氨酰胺培养液，每3～4d换液1次。待细胞汇合成片时，用O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA消化，消化下来的细胞重新悬浮在培养液中，以5×103／cm2的细胞浓度传代培养。