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储存条件：按标签标示分别保存试剂，有效期1年

所需仪器：可见光分光光度计配100μl 比色杯，或酶标仪。******波长405nm，也可测OD400～450nm但灵敏度略降。

操作步骤：

一、组织细胞准备：
Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测******的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1．裂解样本
细胞裂解：1000g离心5分钟收集细胞，吸尽上清。每2～10×106细胞加50～100μl裂解液震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。
组织裂解：3～10mg组织加100μl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。
2．4℃条件下12000g离心10分钟，取上清测定，或-70℃保存。
3．蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1～3mg/ml，相当于每10μl待测样品含10～30μg蛋白，否则应增加细胞用量。

二、测定pNA标准曲线：
1．用反应缓冲液稀释10mM pNA标准品为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μM。设置不加pNA的零管。
2．每一浓度取100μl加入96孔板或100μl比色杯，测定405nm吸光度OD值。
3．每一浓度标准管OD405值为x轴，对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对OD405值的标准曲线。

三、样品测定操作：
1．按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。
2．盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
3．样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量，并以蛋白浓度校正之。
4．测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
a、Caspase活性增加的百分比：100%×实验处理组OD/实验对照组OD，简单而可靠。
b、样品Caspase酶活力单位/mg protein，精确但计算较复杂，参见说明。
反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)
 
无样品空白对照 高酶活性样品 低酶活性样品
反应缓冲液(μl) 95 85 60
待测样品(μl) - 10 35
底物(μl) 5 5 5
总体积(μl) 100 100 100


相关说明：
1．Caspase酶活力单位定义：当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37℃ 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。
2．除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。